分享人一氧化氮（NO）ELISA試劑盒操作說(shuō)明

一氧化氮（NO）酶聯(lián)免疫分析(ELISA)

試劑盒使用說(shuō)明書(shū)

本試劑僅供研究使用       目的：本試劑盒用于測定人血清、血漿、組織勻漿及相關(guān)液體樣本中一氧化氮（NO）的含量。

實(shí)驗原理：

本試劑盒應用雙抗體夾心法測定標本中人一氧化氮（NO）水平。用純化的人一氧化氮（NO）捕獲抗體包被微孔板，制成固相抗體，往包被的微孔中依次加入人一氧化氮（NO），再與HRP標記的檢測抗體結合，形成抗體-抗原-酶標抗體復合物，經(jīng)過(guò)*洗滌后加底物TMB顯色。TMB在HRP酶的催化下轉化成藍色，并在酸的作用下轉化成zui終的黃色。顏色的深淺和樣品中的人一氧化氮（NO）呈正相關(guān)。用酶標儀在450nm波長(cháng)下測定吸光度（OD值），通過(guò)標準曲線(xiàn)計算樣品中人一氧化氮（NO）含量。

試劑盒組成：

注：標準品濃度依次為：200、100、50、25、12.5、0 μmol/L.

樣本處理及要求：

1. 血清：室溫血液自然凝固10-20分鐘，離心20分鐘左右（2000-3000轉/分）。仔細收集上清，保存過(guò)程中如出現沉淀，應再次離心。

2. 血漿：應根據標本的要求選擇EDTA或檸檬酸鈉作為抗凝劑，混合10-20分鐘后，離心20分鐘左右（2000-3000轉/分）。仔細收集上清，保存過(guò)程中如有沉淀形成，應該再次離心。

3. 尿液：用無(wú)菌管收集，離心20分鐘左右（2000-3000轉/分）。仔細收集上清，保存過(guò)程中如有沉淀形成，應再次離心。胸腹水、腦脊液參照實(shí)行。

4. 細胞培養上清：檢測分泌性的成份時(shí)，用無(wú)菌管收集。離心20分鐘左右（2000-3000轉/分）。仔細收集上清。檢測細胞內的成份時(shí)，用PBS（PH7.2-7.4）稀釋細胞懸液，細胞濃度達到100萬(wàn)/ml左右。通過(guò)反復凍融，以使細胞破壞并放出細胞內成份。離心20分鐘左右（2000-3000轉/分）。仔細收集上清。保存過(guò)程中如有沉淀形成，應再次離心。

5. 組織標本：切割標本后，稱(chēng)取重量。加入一定量的PBS，PH7.4。用液氮迅速冷凍保存備用。標本融化后仍然保持2-8℃的溫度。加入一定量的PBS（PH7.4），用手工或勻漿器將標本勻漿充分。離心20分鐘左右（2000-3000轉/分）。仔細收集上清。分裝后一份待檢測，其余冷凍備用。

6. 標本采集后盡早進(jìn)行提取，提取按相關(guān)文獻進(jìn)行，提取后應盡快進(jìn)行實(shí)驗。若不能馬上進(jìn)行試驗，可將標本放于-20℃保存，但應避免反復凍融.

7. 不能檢測含NaN3的樣品，因NaN3抑制辣根過(guò)氧化物酶的（HRP）活性。

操作步驟

• 標準品的加樣：設置標準品孔和樣本孔，標準品孔各加不同濃度的標準品50μL；。
• 加樣：分別設空白孔（空白對照孔不加樣品及酶標試劑，其余各步操作相同）、待測樣品孔。在酶標包被板上待測樣品孔中先加樣品稀釋液40μl，然后再加待測樣品10μl（樣品zui終稀釋度為5倍）。加樣將樣品加于酶標板孔底部，盡量不觸及孔壁，輕輕晃動(dòng)混勻。
• 加酶：每孔加入酶標試劑100μl，空白孔除外。
• 溫育：用封板膜封板后置37℃溫育60分鐘。
• 配液：將20倍濃縮洗滌液用蒸餾水20倍稀釋后備用。
• 洗滌：小心揭掉封板膜，棄去液體，甩干，每孔加滿(mǎn)洗滌液，靜置30秒后棄去，如此重復5次，拍干。
• 顯色：每孔先加入顯色劑A50μl，再加入顯色劑B50μl，輕輕震蕩混勻，37℃避光顯色15分鐘. 
• 終止：每孔加終止液50μl，終止反應（此時(shí)藍色立轉黃色）。
• 測定：以空白孔調零，450nm波長(cháng)依序測量各孔的吸光度（OD值）。 測定應在加終止液后15分鐘以?xún)冗M(jìn)行。

注意事項：

• 試劑盒從冷藏環(huán)境中取出應在室溫平衡15-30分鐘后方可使用，酶標包被板開(kāi)封后如未用完，板條應裝入密封袋中保存。
• 濃洗滌液可能會(huì )有結晶析出，稀釋時(shí)可在水浴中加溫助溶，洗滌時(shí)不影響結果。
• 各步加樣均應使用加樣器，并經(jīng)常校對其準確性，以避免試驗誤差。一次加樣時(shí)間控制在5分鐘內，如標本數量多，推薦使用排槍加樣。
• 請每次測定的同時(shí)做標準曲線(xiàn)，做復孔。如標本中待測物質(zhì)含量過(guò)高（樣本OD值大于標準品孔*孔的OD值），請先用樣品稀釋液稀釋一定倍數（n倍）后再測定，計算時(shí)請zui后乘以總稀釋倍數（×n×5）。
• 封板膜只限一次性使用，以避免交叉污染。
• 底物請避光保存。
• 嚴格按照說(shuō)明書(shū)的操作進(jìn)行，試驗結果判定必須以酶標儀讀數為準.
• 所有樣品，洗滌液和各種廢棄物都應按傳染物處理。
• 本試劑不同批號組分不得混用。

10. 如與英文說(shuō)明書(shū)有異，以英文說(shuō)明書(shū)為準。

計算：

以標準物的濃度為橫坐標，OD值為縱坐標，    

在坐標紙上繪出標準曲線(xiàn)，根據樣品的OD      

值由標準曲線(xiàn)查出相應的濃度；再乘以稀釋      

倍數；或用標準物的濃度與OD值計算出標      

準曲線(xiàn)的直線(xiàn)回歸方程式，將樣品的OD值      

代入方程式，計算出樣品濃度，再乘以稀釋      

倍數，即為樣品的實(shí)際濃度。